Tejido Muscular Liso

MÚSCULO LISO - Tejido Muscular Liso

El músculo liso es responsable de la contractilidad de los órganos huecos, tales como vasos sanguíneos, el tracto gastrointestinal, la vejiga o el útero. Su estructura difiere mucho de la del músculo esquelético, aunque puede desarrollar la fuerza isométrica por área de sección transversal que es igual a la del músculo esquelético. Sin embargo, la velocidad de la contracción del músculo liso es sólo una pequeña fracción de la del músculo esquelético.


Estructura: La característica más llamativa de la musculatura lisa es la falta de estrías transversales visibles (de ahí el nombre de lisa). Las fibras musculares lisas son mucho más pequeños (2-10 m de diámetro) de las fibras musculares esqueléticas (10-100 m). Es habitual para clasificar músculo liso como una sola unidad y el músculo liso de unidades múltiples (Fig. SM1). Las fibras se ensamblan en diferentes maneras. Las fibras musculares que componen el músculo de una sola unidad se reunieron en hojas o en bandas densas. Aunque las fibras se extienden más o menos en paralelo, que están densamente empaquetadas e irregularmente, más a menudo de modo que la parte más estrecha de una fibra se encuentra contra la parte más amplia de su vecino. Estas fibras tienen conexiones, las membranas plasmáticas de las dos fibras vecinas formar uniones de hendidura que actúan como vía de baja resistencia para la rápida propagación de señales eléctricas a través del tejido. Las fibras musculares lisas de unidades múltiples no tienen puentes de interconexión. Ellos se mezclan con fibras de tejido conectivo.



Higo. SM1. Single-unidad y el músculo liso de unidades múltiples.

Las micrografías electrónicas de músculo liso revelan que los filamentos de actina se organizan a través adhesión a los cuerpos densos que contienen un-actinina, una proteína Z-banda en el músculo esquelético. Por lo tanto, se supone que los cuerpos densos funcionan como líneas z. La relación de delgada a filamentos gruesos es mucho mayor en el músculo liso (~ 15: 1) que en el músculo esquelético (~ 6: 1). El músculo liso es rico en filamentos intermedios que contienen dos proteínas específicas, desmina y vimentina.

Inervación y la estimulación: músculo liso es principalmente bajo el control del sistema nervioso autónomo, mientras que el músculo esquelético está bajo el control del sistema nervioso somático. El músculo liso de una sola unidad tiene marcapasos regiones donde las contracciones se generan de forma espontánea y rítmicamente. El contrato fibras al unísono, que es la unidad única del músculo liso es sincitial. Las fibras de músculo liso de múltiples unidades están inervados por fibras nerviosas simpática y parasimpática y responden independientemente uno de otro a la estimulación del nervio.

La estimulación nerviosa en el músculo liso causa despolarización de la membrana, como en el músculo esquelético. Excitación, el evento electroquímica que ocurre en la membrana es seguida por el evento mecánico, contracción. En el caso de músculo liso, este acoplamiento excitación-contracción se denomina acoplamiento electromecánico; el enlace para el acoplamiento es Ca2 + que se respira desde el espacio extracelular en el agua intracelular del músculo liso. Hay otro mecanismo de excitación en el músculo liso, que es independiente de la membrana cambio potencial; que se basa en la activación del receptor por fármacos u hormonas seguido de la contracción muscular. Esto se denomina acoplamiento farmacomecánica. El enlace es Ca2 + que se libera de una fuente interna, el retículo sarcoplásmico.

El papel de los eventos mecánicas del músculo liso en la pared de los órganos huecos es doble: 1) Su contracción tónica mantiene las dimensiones de órganos contra la carga impuesta. 2) Desarrollo de la Fuerza y ​​de acortamiento muscular, al igual que en el músculo esquelético.

Proteínas miofibrilares: En general, el músculo liso contiene mucha menos proteína (~ 110 mg / g de músculo) que el músculo esquelético (~ 200 mg / g). Notable es el contenido de miosina disminuido, ~ 20 mg / g en el músculo liso frente a ~ 80 mg / g en el músculo esquelético. Por otro lado, las cantidades de actina y tropomiosina son los mismos en ambos tipos de músculo. El músculo liso no contiene troponina, en vez de que hay otras dos proteínas de filamentos delgados, caldesmón y calponin.

La secuencia de aminoácidos de la actina de músculo liso es muy similar a la de su contraparte músculo esquelético, y parece probable que sus estructuras tridimensionales son también similares. Actina de músculo liso se combina con cualquiera de miosina del músculo liso o esquelético. Sin embargo, hay una diferencia importante en la activación de la miosina ATPasa por la actina, la miosina del músculo liso tiene que ser fosforilada para que se produzca la actina-activación.

El tamaño y forma de la molécula de miosina del músculo liso es similar a la de la miosina del músculo esquelético (Fig. M1). Hay una pequeña diferencia en la composición de la cadena ligera; de las cuatro cadenas ligeras de la miosina del músculo liso dos tienen peso molecular de 20.000 y dos de 17.000. La cadena ligera 20000 es fosforilable. Tras la fosforilación de la cadena ligera de la actina-miosina del músculo liso activado ATPasa aumenta aproximadamente 50 veces, a aproximadamente 0,16 moles de ATP por mol de hidrolizado cabeza de miosina por seg, a la fuerza iónica y temperatura fisiológicos. (En las mismas condiciones, la miosina de músculo esquelético de actina-ATPasa activada es 10 -20 mol / mol / seg). La dependencia de la fuerza iónica de la miosina del músculo liso Ca2 + ATPasa -activated también difiere de la de la miosina del músculo esquelético (Fig. M5), aumentando la fuerza iónica aumenta el músculo liso miosina ATPasa, pero disminuye el músculo esquelético miosina ATPasa.

Cuatro de miosina del músculo liso specifc isoformas de cadena pesada son conocidos (descrito en Quevillon-Chéruel et al., 1999). Dos isoformas (SMB llamado y SMA) se definen por la presencia o la ausencia de una inserción de siete aminoácidos en la región de cabeza globular N-terminal. Los otros dos (SM1 y SM2) difieren en su extremo C-terminal en un 43 frente a 9 aminoácidos. Para entender el papel de las extremidades C-terminal de SM1 y SM2 en el montaje del músculo liso filamento grueso, diversos fragmentos de estas miosinas, tales como la región de la varilla, la varilla sin cordal, o meromyosins luz se prepararon como proteínas recombinantes en células bacterianas (. Rowner et al, 2001; Quevillon-Chéruel et al, 1999.). Los resultados mostraron que los herrajes de miosina del músculo liso afectan diferencialmente conjunto de filamentos y sugirieron que los filamentos gruesos homogéneos que contienen SM1 o SM2 miosina podrían servir funciones distintas dentro de las células musculares lisas.

Aunque el mecanismo de ensamblaje de filamento grueso para myosins músculo liso purificadas in vitro se ha descrito, la regulación de la formación de filamento grueso del músculo intacto es poco conocido. Densidad de la sección transversal de los filamentos gruesos midió microscópicamente de electrones en el músculo liso de las vías respiratorias intactas (Herrera et al., 2002) demostraron que la densidad aumentó sustancialmente (144%) cuando se activó el músculo. En músculo en reposo, en ausencia de Ca2 +, la densidad de filamento disminuyó en un 35%. Parece que existe en el músculo liso miosina filamentosa en equilibrio con la miosina monomérica; activación favorece la formación de filamentos.

Kathleen Trybus fue pionera en la expresión y purificación de subfragmentos miosina del músculo liso por medio del sistema de expresión de células baculovirux / insecto. Este procedimiento y los métodos necesarios para caracterizar las nuevas proteínas (gel de ensayos, determinaciones de la actividad ATPasa, parámetros cinéticos estado transitorio, y el ensayo de la motilidad in vitro) se describen en su revisión (Trybus, 2000). Estudios sobre la miosina del músculo liso y de ingeniería pesada meromiosina mostraron: la interacción entre los dominios de la cadena ligera reguladora en dos cabezas es crítica para la regulación de la miosina del músculo liso;, un largo y débilmente (Li et al, 2000 Sweeney et al, 2000.). se requiere bucle de unión a la actina cargada para la regulación dependiente de la fosforilación de la miosina del músculo liso (Rovner, 1998), y de desenrollado espiral de la bobina en la miosina del músculo unión cabeza-varilla lisa se ​​requiere para un rendimiento mecánico óptimo (Lauzon et al., 2001) .

In vitro, tanto caldesmón y calponin están inhibiendo la actividad de ATPasa de actina-miosina activada del músculo liso fosforilado. En caso de calponin, esta actividad inhibidora se invierte por la unión de Ca2 + -calmodulina o por fosforilación. Calponin es una proteína de 34 kDa que contiene sitios de unión para la actina, tropomiosina y Ca2 + -calmodulina. Caldesmon es una solución flexible, proteína de largo, 87-kDa que contiene sitios de unión para la miosina, así como la actina, la tropomiosina, y Ca2 + -calmodulina. La microscopía electrónica y la reconstrucción de la imagen tridimensional de aisladas de músculo liso filamentos delgados revelaron que calponin y caldesmón están situadas periféricamente a lo largo de la actina hélice de paso largo (Hodgkinson et al, 1997;. Lehman et al, 1997.). Se desconoce el papel fisiológico de caldesmón o calponin.

La fosforilación y desfosforilación de la cadena de 20 kDa miosina Luz

Cadena ligera de miosina quinasa y de la cadena ligera de la miosina fosfatasa: músculo liso (así como el músculo esquelético y cardíaco) contiene la cadena ligera de la miosina quinasa (MLCK), activado por Ca2 + -calmodulina, la enzima que transfiere el grupo fosfato terminal del ATP a serina (y / o treonina) grupos hidroxilo de la cadena ligera fosforilable (LC) de acuerdo con la siguiente reacción:

LC-OH + MgATP2- ® LC-O-PO32- MgADP- + + H + (1)

Desfosforilación es provocada por el músculo liso de la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina (PCML) de acuerdo con la siguiente reacción:

LC-O-PO32- + H2O ® LC-OH + HPO42- (2)

Las propiedades de MLCK son revisados ​​por Stull et al. (1996) y las propiedades de MLCP son revisados ​​por Hartshorne et al. (1998).

En general se cree que la fosforilación LC-desfosforilación controla el ciclo de contracción-relajación del músculo liso:



Durante mucho tiempo, la investigación se centró en el papel de MLCK de la contractilidad del músculo liso, pero recientemente el interés se desplazó al PCML. Resultó que MLCP se compone de tres subunidades: una subunidad catalítica de 37-38 kDa de la fosfatasa de tipo 1, una subunidad de aproximadamente 20 kDa cuya función no se conoce, y una subunidad grande de 110-130 kDa que los objetivos PCML a la miosina. La actividad de la fosfatasa de la subunidad catalítica es baja y se mejora significativamente por la adición de la subunidad de orientación. Tras la fosforilación de residuos de serina y treonina en la subunidad de focalización, su efecto sobre la activación de la subunidad catalítica se pierde, y de ese modo la holoenzima MLCP se inhibe.

Informes recientes (Feng et al, 1999;. Kaibuchi et al, 1999;. Nagumo et al, 2000;. Somlyo y Somlyo, 2000;. Sward et al, 2000) indican que en el músculo liso existe un sistema regulado por Rho de MLCP . Rho-quinasa es el actor principal en este sistema, la enzima fosforila la subunidad de unión a miosina 130 kDa del PCML y por lo tanto inhibe la actividad MLCP. Debido a la antagonismo entre MLCK y PCML, la inhibición de MLCP resulta en un aumento en el contenido de fosforilo de LC con un aumento concomitante en la fuerza muscular. En estas condiciones, submáximas de Ca2 + -niveles son suficientes para la fuerza máxima, un fenómeno llamado aumentó Ca2 + -sensibilidad (Somlyo y Somlyo, 1994). Los inhibidores específicos para la quinasa Rho Y-27632 (Feng et al, 1999;.. Kaibuchi et al, 1999), y HA-1077 (. Nagumo et al, 2000;. Sward et al, 2000) están disponibles.

MLCP actividad también puede ser inhibida por una proteína de 17-kDa de la miosina fosfatasa inhibidor, llamado CPI-17, que inhibe la subunidad catalítica de la holoenzima y MLCP MLCP (Kitazawa et al., 2000),. La fosforilación de CPI-17 en Thr38 aumenta su potencia inhibidora de 1000 veces. La estructura de la solución RMN de CPI-17 ha sido determinada. (Ohki et al., 2001), se forma una novela de cuatro hélices. La fosforilación de Thr38 induce un cambio conformacional que implica el desplazamiento de una hélice sin movimiento significativo de los otros tres hélices. Rho-quinasas PKC y son responsables de la fosforilación de CPI-17.

Una rica variedad de segundos mensajeros a regular la actividad PCML en condiciones fisiológicas y patológicas (Solaro, 2000) a través de la fosforilación de la subunidad sea la orientación del PCML o CPI-17.

La miosina fosforilación de la cadena ligera intacta en el músculo liso: 32P-etiquetado del músculo es un método fiable para tales estudios. Cuando un músculo liso disecados, por ejemplo, o una tira de la arteria uterina, se incuba a 37 ° C en solución salina fisiológica que contiene fosfato inorgánico radiactivo, el 32P impregna la membrana plasmática y entra en el espacio intracelular del músculo. A través del mecanismo de la fosforilación oxidativa 32P incorpora en el grupo P terminal del ATP:

ADP + 32P ® ADP32P

La transferencia de la 32P terminal del ATP a LC-OH por MLCK (ecuación 1) produce los radiactivos LC-O-32PO32- especies que se pueden aislar y cuantificadas. El aislamiento implica dos dimensiones (2D) electroforesis en gel y la cuantificación requiere la medición de la radiactividad específica del terminal P de ATP.

La contracción del músculo liso se correlaciona con la fosforilación LC (revisado por Bárány y Bárány, 1996c). Higo. SM2 ilustra un experimento: Dos arterias carótidas fueron disecados de cerdos recién sacrificados y se marcaron con 32P. Una arteria se contrajo con KCl durante 30 segundos después se congelaron en nitrógeno líquido, mientras que la otra arteria estaba congelado en el estado de reposo. Las arterias se pulverizaron, se lavó con ácido perclórico para precipitar las proteínas musculares y eliminar metabolitos de fosfato que contiene 32P-desde el músculo. El residuo se lavó se neutralizó con una solución de NaOH después se disolvió en dodecilsulfato de sodio (SDS). Después de la centrifugación a alta velocidad para eliminar las partículas insolubles, se determinó el contenido de proteína del sobrenadante y partes alícuotas de 360 mg de proteína se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida 2D. Este procedimiento separa las proteínas en función de su carga (pH 4-6) en la primera dimensión y de acuerdo a su tamaño (SDS) en la segunda dimensión. Después de la tinción, el perfil de las proteínas arteriales apareció, se muestra en la fila superior de la figura. SM2. LC, es en la parte media inferior del gel, que contiene múltiples lugares. Las manchas de LC fueron escaneados, las intensidades de tinción se muestran en la fila inferior de la figura. Las manchas radiactivas en el gel se detectaron mediante autorradiografía, la fila central de la fig. SM2 muestra los puntos negros en la película corresponde a las manchas radiactivas en el gel.

La inspección visual de los lugares LC radiactivos en la Figura muestra mucho más radiactividad en LC del músculo que se contrae (derecha) que del músculo en reposo (izquierda). Se puede calcular la incorporación de la 32P-fosfato en LC como sigue. Primero hay que determinar la radiactividad específica del terminal P de ATP del músculo. El ATP se encuentra en el extracto de ácido perclórico del músculo congelado y pulverizado, descrito antes, y Bárány y Bárány (1996c) describen la determinación de la radiactividad específica. El siguiente paso es la determinación de la radiactividad en LC: los puntos de gel se extirpan, se digirió con H2O2, y después de que se disuelva el gel, se mide la radiactividad (cuentas por minuto). El grado de fosforilación LC puede calcularse a partir de la radiactividad en los puntos de LC y en el fosfato terminal del ATP, de la proteína total aplicada sobre el gel, y desde el contenido de LC de la proteína total (Bárány y Bárány, 1996c). Este cálculo muestra que bajo las condiciones de la figura. SM2, el LC del músculo en reposo contenía 0,25 mol 32P-fosfato / LC mol, mientras que la LC del músculo que se contrae contenía 0,70 mol. Por lo tanto, 0,45 mol 32P-fosfato se transfiere por MLCK desde el fosfato terminal de ADP32P para liberar grupos LC-OH como resultado de la contracción muscular.





Higo. SM2. Fosforilación de la cadena ligera durante la contracción del músculo liso como estudió por electroforesis en gel 2D. (Bárány y Bárány, 1996a, con el permiso de Bioquímica de la contracción del músculo liso, 1996, Academic Press). A la izquierda, músculo de la arteria carótida porcina marcada con 32P se congeló en reposo. Derecha, músculo arterial carótida porcina marcada con 32P se congeló 30 segundos después de 100 mM KCl reto. El panel superior muestra el patrón de tinción con azul de Coomassie de las proteínas arteriales; panel del medio muestra los autorradiogramas correspondientes; panel inferior muestra las correspondientes exploraciones densitométricos de LC.

Las isoformas de la cadena ligera de la miosina 20-kDa: isoformas de la proteína tienen el mismo tamaño, pero diferente carga. Se generan ya sea por la modificación de proteínas o la alteración genética. La fosforilación de proteínas es la modificación de la proteína fisiológica, debido a la fosforilación de una proteína aumenta su carga negativa. Por lo tanto, LC tiene al menos dos isoformas, una no fosforilada y una fosforilado. La alteración genética cambia la composición de aminoácidos de una proteína, proporcionando de este modo al menos dos isoformas. Por ejemplo, LC completamente desfosforilado exhibe dos puntos en geles 2D (Fig. SM3) con una distribución porcentual de 85% y 15%, correspondiente a los mayores y menores isoformas LC.



Higo. SM3. De miosina de cadena ligera como se analizó por electroforesis en gel 2D. LC se desfosforiló por homogeneización de las arterias carótidas porcinas en NaCl 150 mM y EGTA 1 mM, seguido de incubación a 25oC durante 2 horas. Top, gel de colores, manchas LC están numerados como 2 y 4, que corresponde a su número isoforma. Bottom trazado, densitométrico de los lugares de LC.

Si tanto LC mayor y menor son fosforilada, que se traduce en cuatro isoformas (dos no fosforilados y dos fosforilados). En la fig. SM2 en la parte superior de nivel cuatro isoformas de LC se ven; en el nivel medio, los autorradiogramas revelan que tres puntos son radiactivos. El, más punto básico no radiactivo, corresponde a la isoforma principal de LC (Fig. SM3).

Figura SM4 ilustra la formación de las isoformas de LC como resultado de la fosforilación. La isoforma principal (LCA) cuando está fosforilada mono-(LSA) se mueve desde Spot 3, y también cuando es di-fosforilada (2PLCa) se mueve desde Spot 2. el mismo lugar 2 contiene la isoforma menor no fosforilada (LCB), así la comigración de la isoforma LC di-fosforilado con la isoforma menor hace Spot 2 radiactivo. Esto explica por qué de los cuatro spots LC tres son fosforilada. La isoforma menor mono-fosforilada (PLCb) se mueve en Spot 1, que es el lugar más ácida.



Higo. SM4. Esquema para la explicación de cuatro de colores y tres puntos LC radiactivos, que se muestra en la figura. SM2. (Bárány y Bárány, 1996a, con el permiso de Bioquímica de la contracción del músculo liso, 1996, Academic Press).

La última fila de la figura. SM2 muestra los cambios musculares de contracción inducida-en la intensidad de la tinción de manchas LC. En el músculo en reposo el último pico, la isoforma principal no fosforilada contiene tanto como 63% de la intensidad total, que disminuye a 35% en la contratación, músculo. Al mismo tiempo, la intensidad de 23% en el pico anterior de las reposo músculo aumenta a 49% a la contracción. Este es un ejemplo de un método simple (pero no sensible) para seguir los cambios en la fosforilación de LC durante la contracción, sin usar 32P-etiquetado del músculo.

Sitio de fosforilación: La secuencia de aminoácidos de LC presenta una similitud entre las CL de varios músculos lisos. Tal secuencia conservadora sugiere un significado funcional de la proteína. Los sitios de fosforilación se encuentran en la parte terminal amino de la molécula de LC, que se muestra en la figura. SM5. Serina 19 es el sitio que está fosforilada por MLCK en el músculo intacto. Treonina 18 es fosforilada por MLCK raramente. Al lado de MLCK, la proteína quinasa C (PKC) también fosforila LC; los sitios implican Serina 1, 2 Serina, Treonina y 9.



Higo. SM5. Sitios de fosforilación de LC.

Mapeo de péptidos trípticos de dos dimensiones: mapas de fosfopéptidos diferencian MLCK catalizada por LC fosforilación de que catalizada por PKC (Erdodi et al, 1998.). Higo. SM6 ilustra el experimento: Con ADP32P como sustrato, Pure LC se fosforiló ya sea por MLCK (panel central), o PKC (panel derecho). Actomiosina que contiene LC endógena, MLCK, y PKC, también fue fosforilada (panel izquierdo). El 32P-LC se aisló por electroforesis en gel 2D, digerido por la tripsina y los péptidos se separaron mediante mapeo de péptidos 2D. El mapa de LC fosforilada por MLCK exhibe cuatro péptidos: A, B, ambas que contienen residuos de serina, correspondiente al sitio de Ser-19, y C, D, que contiene tanto treonina, que corresponde al sitio Thr-18. Cuando LC es fosforilado por la PKC, el mapa presenta dos péptidos: E, que contiene serina, correspondiente a Ser-Ser-1 o 2 sitio, y F, que contiene treonina, que corresponde a theThr-9 sitio. Cuando LC se fosforila en actomiosina, péptidos característicos tanto para MLCK PKC y la fosforilación están presentes.



Higo. SM6. Autoradiogramas de phosphopeptide mapas 2D de tríptico resúmenes LC.

Sobre la base de mapeo de péptidos de dos dimensiones, se pueden identificar las enzimas que fosforilan LC durante la contracción del músculo liso (Fig. SM7). El patrón de fosfopéptidos de LC de K + -contracted arteria (parte izquierda) es prácticamente idéntica a la de LC} {MLCK patrón que se muestra en la figura. SM6; por lo tanto, la conclusión es clara, MLCK es la principal enzima que fosforila LC durante el K + -contracción. En contraste, cuando el músculo se contrae con dibutirato de forbol (PDBu), un activador de la PKC, el patrón de LC (parte derecha) se asemeja al de Actomiosina muestra en la figura. SM6, por lo tanto, ambas enzimas, MLCK y PKC fosforilan LC durante el PDBu-contracción. Se puede determinar la contribución de cada enzima para la fosforilación, ya sea por densitometría de los lugares, o mediante recuento de la radioactividad en las manchas, los resultados mostraron aproximadamente un 35% de contribución por la PKC.



Higo. SM7. Mapas de fosfopéptidos de LC de K + del músculo -contracted frente músculo tratado-PDBu.

El papel del Ca2 + en la fosforilación de la cadena ligera: Como en el músculo esquelético, Ca2 + también juega un papel central en la contractilidad del músculo liso. En el músculo esquelético TN-C es el objetivo de la myoplasmic Ca2 +, mientras que en el músculo liso de Ca2 + activa MLCK. En realidad, el Ca2 + complejado a la calmodulina es el activador de la enzima. De acuerdo con los estudios in vitro, intacta contratación cese del músculo liso cuando Ca2 + se omite de la solución de baño, o cuando se compleja con EGTA. Además, los inhibidores de la calmodulina, como trifluoperazina o clorpromazina inhiben la contracción del músculo liso.

En el músculo en reposo no es de aproximadamente 0,1 mM de Ca2 +, tras la estimulación de los concentración de Ca2 + aumenta aproximadamente 100 veces a través de acoplamiento electromecánico o farmacomecánica. Es convencional utilizar indicadores fluorescentes para seguir los cambios en la concentración intracelular de Ca2 + inmediatamente después de la estimulación y durante la meseta de la actividad mecánica. Grandes variaciones se reportan, dependiendo de la naturaleza del músculo liso, la preparación del tejido, o el fármaco utilizado. Sin embargo, todos los investigadores están de acuerdo en que, a fin de provocar la relajación del Ca2 + nivel en el sarcoplasma debe ser devuelto cerca del valor de reposo. Dos mecanismos participan en la disminución del nivel de Ca2 +: 1) La membrana Ca2 + en plasma transportar bombas ATPasa Ca2 + desde el interior en el espacio extracelular. 2) El sarco (endo) plasmático Ca2 + del retículo transportar bombas ATPasa Ca2 + en el SR.

Stretch-inducida luz fosforilación de la cadena: Como se mencionó antes, el músculo liso puede ser estimulado eléctricamente o por agentes químicos. Aquí se describe la activación mecanoquímica de músculo liso. El estiramiento de los músculos arteriales o uterinas inducidas por la fosforilación de la cadena ligera en la misma medida como se observó en los músculos contraídos por K + o norepinefrina (Bárány y Bárány, 1996c). Los músculos que se estiraron 1,6 veces su longitud en reposo no desarrollaron tensión, pero contrajeron normalmente cuando el estiramiento se libera y los músculos se les permitió regresar a su longitud en reposo. Es importante destacar que esta contracción fue espontánea, lo que indica que la activación inducida por estiramiento-lleva toda la información necesaria para la contracción normal. La movilización de Ca2 + era necesario para la cadena ligera de la fosforilación inducida por estiramiento y contracción que se produzca. Cuando se añadió EGTA (la fuerte Ca2 + formador de complejos) para el baño de los músculos tanto la fosforilación inducida por estiramiento y la tensión inducida por la liberación de estiramiento fueron inhibidas; sin embargo, después de la retirada de EGTA mediante lavados, ambos procesos se restauraron completamente. El tratamiento del músculo con la clorpromazina (el inhibidor de calmodulina) también abolió tanto la fosforilación LC tramo inducida y el desarrollo de tensión inducida por la liberación de estiramiento. Estos resultados sugieren la presencia de receptores en el músculo liso mechanosensitive que están interactuando con canales de liberación de Ca2 + en SR.

Otros comentarios están garantizados en el hallazgo de que 1,6 veces estiran los músculos, que son incapaces de contratar (porque no hay solapamiento entre actina y miosina), son capaces de fosforilar plenamente su LC. En consecuencia, la contracción del músculo liso y la fosforilación LC no están acoplados. Golf Tiempo de experimento también demostró que la fosforilación LC precede desarrollo de tensión. Por lo tanto, LC fosforilación desempeña un papel en el proceso de activación, pero no en la contracción per se. Además, K + -contracted músculo mantiene su tensión durante un tiempo prolongado aunque su LC se convierte en desfosforilado. Este es otro ejemplo de la falta de acoplamiento entre el contenido de fosfato de LC y la contractilidad del músculo.

La fosforilación de Proteínas del Choque Térmico

Proteínas de schock térmico de bajo peso molecular son fosforilados en el músculo liso: Una proteína de 27-28 kDa es fosforilada en diversos músculos lisos intactas y células musculares lisas (revisado en Bárány y Bárány, (1996c) cíclico vasorrelajación dependiente de nucleótidos está asociado con el. fosforilación de una proteína de choque térmico de 20 kDa, llamada HSP20 (Beal et al, 1997;.. Rembold et al, 2000). se encontró que HSP20 es una proteína actina asociado (Brophy et al, 1999;. Rembold et al . 2000) lo que sugiere que la relajación del músculo liso puede ser provocada por la unión de la HSP20 fosforilada a los filamentos de actina.

Transducción de Señales

La unión de un agonista (por ejemplo, norepinefrina o la oxitocina) para el receptor de la superficie del músculo liso induce una señal que se propaga desde el exterior hacia el interior de la membrana plasmática y activa varios efectores que en última instancia inician la contracción. Hay tres componentes de este sistema que discutimos: 1) El inositol 1,4,5-trifosfato, 2) las proteínas G, 3)-fosfoinositida específica fosfolipasa C.

El inositol 1,4,5-trifosfato: El anillo de inositol contiene seis residuos hidroxilo, la mayoría de ellos puede ser fosforilados por quinasas específicas. El inositol 1-monofosfato es el constituyente de fosfatidilinositol (PI) uno de los fosfolípidos de las membranas celulares animales. PI 4-quinasa y PI (4) P 5-quinasa para generar PI (4) P y PI (4,5) P2, respectivamente, secuencialmente fosforilar PI. Dentro de la membrana celular reside un phosphoinositide fosfolipasa C específica, uno de su producto hidrolítico es inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), (véase la fig. SM 8).



Higo. SM8. D-mio-inositol 1,4,5-trifosfato. (Bárány y Bárány, 1996b, con el permiso de Bioquímica de la contracción del músculo liso, 1996, Academic Press). La flecha indica el sitio del enlace éster con diacilglicerol en fosfatidilinositol. La carga negativa del grupo fosfato no está indicado.

G-proteínas: Las proteínas (proteínas G) de unión de nucleótidos de guanina son heterotrímeros consisten en A, B y G-subunidades. La A-subunidades parecen ser más diversas y se cree que son responsables de la especificidad de la interacción de diferentes proteínas G con sus efectores. Higo. SM9 representa un modelo sencillo para la activación de proteínas G. En el estado basal, la una subunidad contiene GDP unido y asociación de A y bg subunidades está muy favorecida, manteniendo la proteína G en la forma inactiva. La estimulación de los resultados de la proteína G cuando se une GTP en lugar del PIB. Los receptores interactúan de manera más eficiente con la forma heterotrimeric de la proteína G y aceleran la activación mediante el aumento de la tasa de disociación de PIB y la mejora de la asociación de GTP. La activación de la proteína G acoplada receptor da como resultado la disociación de las proteínas G heterotriméricas en un subunidades y BG-dímeros. Por último, la proteína G a-subunidad tiene una actividad hidrolítica intrínseca que convierte lentamente GTP a GDP y devuelve la proteína G a su forma inactiva.



Higo. SM9. Modelo para la activación de proteínas G. (Bárány y Bárány, 1996b, con el permiso de Bioquímica de la contracción del músculo liso, 1996, Academic Press).

-Phosphoinositide fosfolipasa C específica: Este término se refiere a una familia de enzimas específicas para todo el resto phosphoinositide del fosfatidilinositol, pero que difieren en su especificidad en función del número de los grupos fosforilo en el anillo inositol. El b-, y d-isoformas g- de PI-fosfolipasa C (PI-PLC) muestran la mayor especificidad para el fosfolípido trisphosphorylated (PIP2)). Hay dos mecanismos básicos por los que activan los agonistas de PIP2 hidrólisis (Fig. SM10). En el caso de las hormonas, neurotransmisores y otros agonistas, la señal se transduce a b-isoenzimas de PI-PLC. La fila superior izquierda de la figura. SM10 muestra la vía más común para la activación de PI-PLCb-isoforma, iniciado por la estimulación de un receptor-a1-adrenérgicos (a1-R) con norepinefrina (NE), y que implican GAQ proteínas. La fila inferior izquierda muestra la activación de PI-PLC-b isoformas, iniciado por la acetilcolina (ACH) la estimulación del receptor muscarínico M2-(M2-R), y mediada por la b-g subunidad de la proteína G sensible a la toxina pertussis (GI). En cuanto al otro mecanismo básico de activación, por ejemplo, en el caso de factores de crecimiento, la activación de sus receptores da como resultado una mayor actividad de la tirosina quinasa. La parte derecha de la figura. SM10 muestra la activación de PI-PLC-g isoformas, iniciado por la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a sus receptores, y ejecutado por la fosforilación de la tirosina (YP) de PI-PLC-g. En los tres ejemplos, el activado PI-PLC hidroliza PIP2 para formar los mensajeros IP3 y diacilglicerol (DAG). IP3 libera Ca2 + del retículo sarcoplásmico y con ello inicia la contracción del músculo liso. DAG activa la proteína quinasa C, el resultado exacto de esta activación no se conoce en el nivel celular.



Higo. SM 10. Caminos para la activación de las isoformas de PI-PLC. (Bárány y Bárány, 1996b, con el permiso de Bioquímica de la contracción del músculo liso, 1996, Academic Press). .

El Evento contráctil del músculo liso

Un esquema para la contracción del músculo liso se muestra en la figura. SM11. La contracción se inicia por el aumento de Ca2 + en el myoplasm; esto ocurre en las formas siguientes:

Ca2 + puede entrar desde el fluido extracelular a través de canales en el plasmalema. Estos canales abiertos, cuando el músculo es estimulado eléctricamente o el plasmalema se despolariza por el exceso de K +.
Debido a la activación del receptor inducida por el agonista, Ca2 + puede ser liberado desde el retículo sarcoplásmico (SR). En esta vía, el receptor activado interactúa con una proteína G (G) que a su vez activa la fosfolipasa C (PLC). El PLC activada hidroliza el fosfatidil inositol difosfato; un producto de la hidrólisis es de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3). IP3 se une a su receptor en la superficie de la SR, esto abre canales de Ca2 + y Ca2 + a partir de SR está entrando en el myoplasm.
Ca2 + se combina con la calmodulina (CaM) y el Ca2 + -CAM complejo activa MLCK, que a su vez fosforila LC. El filamento de miosina fosforilada combina con el filamento de actina y el músculo se contrae.


Higo. SM11. Un esquema para la contracción del músculo liso. (Bárány de 1996, con el permiso de Bioquímica de la contracción del músculo liso, 1996, Academic Press).

Two books (Bárány, 1996; Kao and Carsten, 1997) and a special journal issue (Murphy, 1999) are recommended for further studying the mechanism of smooth muscle contraction.and relaxation.

Monomer (G) to Polymer (F) Transformation of Actin in Smooth Muscle

Mehta and Gunst (1999) and Jones et al (1999) reported the existence of G-actin in smooth muscle, based on the method of DNase I inhibition and phalloidin staining, respectively. Subsequently, Bárány, et al (2001) showed the exchange of the actin-bound nucleotide in intact smooth muscle. This was based on the separation of the actin bound nucleotides from the cytoplasmic nucleotides with 50% ethanol (Fig. SM12).



Higo.SM12.Extraction of nucleotides and radioactivity from 32P-labeled arterial smooth muscles (From Bárány et al., 2001).The percentage of the total absorbance and counts eluted from the muscles in 8 extractions is shown on the ordinate.

32P-labeled arterial smooth muscles were extracted in the refrigerator several times for elutions of the nucleotides (Absorbance at 260 nm) and the 32P-label (Counts). The absorbance and the counts are very high in the first extract and drop in the successive five extractions virtually to zero. In the 7th and 8th elution the muscles were extracted with 1.5% perchloric acid (PCA). New absorbance and radioactivity appeared, corresponding to the release of the bound-nucleotide and the associated 32P-label from actin.

The composition of the PCA extract is shown on Fig. SM13.



Higo.SM13.Dowex -1 chromatography of Extracts No. 7 and 8, shown in Fig.SM12.(From Bárány et al., 2001).Squares correspond to Counts per ml and triangles correspond to Absorbance.

Three radioactive peaks are seen, the first from Pi, the second from ADP, and the third from ATP. For ADP and ATP the absorbance is also shown; 85% of the total absorbance is from ADP and 15% from ATP. Since F-actin contains bound-ADP and G-actin contains bound-ATP, the data indicate that 85% of the total actin in this muscle preparation was in the polymeric and 15% in the monomeric form. Determination of the Pi concentration by a colorimetric method showed that the molar ratio of Pi to ADP was close to one.

In order to quantify the extent of exchange of the actin-bound nucleotide and Pi, one has to determine their specific activity (counts /min/mol nucleotide or Pi) and compare it with those of the specific activities (s.a.) of the gamma- and beta-phosphates of the cytoplasmic ATP and that of PCr (Bárány et al., 2001). With this knowledge one can calculate the percentage exchange for each of the actin components; for instance , the percentage exchange of the actin-bound- ADP is:

(s.a. of actin-ADP/s.a. of beta-P of cytoplasmic ATP) x 100

Higo.SM14 compares the exchange of the actin-bound ADP between smooth and skeletal muscles.The exchange is rapid in smooth muscle, half-time about 15 min, whereas the exchange is slow in skeletal muscle, about 15% in three hours, in agreement with the studies of Martonosi et al., 1960) in live animals.



Higo.SM14.Time course of the exchange of the actin-bound ADP in smooth (porcine carotid artery) and skeletal (rat vastus lateralis) muscle.(From Bárány et al., 2001).


 Characteristics of the exchange of the actin-bound nucleotide in smooth muscle:

ATP is a prerequisite for the exchange to take place. If ATP synthesis is inhibited by azide or iodoacetamide the exchange is also inhibited. If ATP sysnthesis is reduced, by incubation of the muscles with deoxyglucose, instead of glucose, the exchange is also reduced.

Ca2+ is not required for the exchange, i.e. full exchange is observed in the muscle in the presence of EGTA.

Several smooth muscles, arteries, uteri, urinary bladder, and stomach exhibiited the exchange of the actin-bound nucleotide and phosphate, suggesting that the exchange is a property of every smooth muscle.

Upon contraction of smooth muscle, the exchange of the bound-nucleotide and phosphate decreased and upon relaxation from the contracted state it increased, suggesting that polymerization-deplolymerization of actin is a part of the contraction-relaxation cycle of smooth muscle.

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